APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

1)   HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

2)   Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

3)   Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

4)   Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

5)   Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

6)   Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

7) Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.

8) HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

Beberapa contoh penelitian     :

Analisis Anion Nitrat (NO₃^-)

Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri. Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut. Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta eluen campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor Konduktivitas dapat menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi 3,661 ppm dan sensitivitas 0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.

Analisis Vitamin C

Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni dalam menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.

Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae

Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp. terdapat komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol, heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan selektifitas (resolusi) yang tinggi, kromatografi cari kinerja tinggi (HPLC) untuk komponen yang termolabil, seperti dilakukan untuk stabilitas kandungan gingerol dari rimpang Jahe dan andrografolid dari Sambiloto.

Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi dibutuhkan cara eluasi gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip pasangan ion.

Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-perkolasi dengan pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat diuapkan dengan rotavapor sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk simplisia, diperoleh suatu ekstrak total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali dalam metanol ( 10X), kemudian dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm) untuk selanjutnya diinjeksikan sejumlah 20 ul ke HPLC.

Kondisi HPLC dalam penelitian adalah sbb.: Eluasi dilakukan gradien pada kondisi awal Solvent-A (As-fosfat 0,1 N dalam aquabidestillata) : Solvent B
(Metanol pro HPLC) = 90 10; kemudian program gradien linear selamn 35 menit menuju 100% Metanol, dilanjutkan 15 menit Metanol 100%, dilanjutkan program pencucian kolom dengan 40% MetOH selama 10menit, dan diakhiri kembali kekondisi awal (10% MetOH) dalam waktu 5 menit. Kromatogram direkam selama total waktu 60 menit. Setiap kali injeksi bahan uji (ekstrak) memerlukan waktu 75 menit, kemudian dapat langsung diinjeksikan bahan uji berikutnya. Analisis HPLC dilakukan pada setiap sampel ekstrak dengan kondisi eluasi dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm 365 nm. Analisis data : Sidik jari HPLC masing-masing ekstrak dianalisis dan dibedakan berdasarkan jumlah puncak komponen dan waktu retensinya untuk dicari karakterisasinya jika ada dalam campuran atau dalam produk.

Dari hasil pengamatan kromatogram, dapat disimpulkan bawah pada ekstrak C.domestica, C.xanthorrhiza dan C.zedoaria, jumlah puncak pada 254nm sama dengan jumlah puncak yang muncul pada 365nm juga dan jumlah puncak pada 365nm lebih besar dari pada jumlah puncak 254nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan deteksi pada 365nm. Pada ekstrak Alpinia galanga, Z.cassumunar, Z.zerumbet dan K.galanga, jumlah puncak pada 365nm sama dengan jumlah puncak yang muncul pada 254nm juga dan jumlah puncak pada 254nm lebih besar dari pada jumlah puncak 365nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan deteksi pada 254nm. C heyneana, C aeroginosa, Z offinalis, K pandurata, K angustifolia dan K rotunda jumlah puncak yang muncul sama pada 254nm dan 365nm lebih kecil dari jumlah puncak pada 254nm dan pada 365nm, sehirigga untuk pembuatan sidik jari kromatogram HPLC harus digunakan kombinasi deteksi pada 254nm clan 365nm.

Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya menilai sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak.

Hasil penelitian tugas akhir yang telah dilakukan menunjukkan bahwa metode ultrasonik dapat dipakai untuk menentukan tingkat kematangan buah manggis secara tidak merusak. Berdasarkan basil kalibrasi 80 buah manggis, kecepatan gelombang ultrasonik yang merambat melalui buah manggis untuk tiap tingkat kematangan mempunvai nilai yang berbeda-beda. Buah manggis yang masih mentah mempunyai kecepatan gelombang ultrasonik rata-rata 337.4 m/s, untuk buah setengah matang 369.1 m/s, buah matang 397.4 mis, serta untuk buah Iewat matang mempunyai nilai kecepatan rata-rata 449.6 mis. Nilai kecepatan rata-rata gelombang ultrasonik yang merambat pada tiap tingkat kematangan buah digunakan untuk membuat suatu persamaan empiris. Persamaan ini menghubungkan tingkat kematangan terhadap kecepatan gelombang ultrasonik untuk memperkirakan tingkat kematangan berdasarkan ultrasonik. diperoleh Tk = 0.0268 V 7.9258.

Persamaan empiris yang diperoleh diuji dengan pengukuran kecepatan pada berbagai kondisi buah dengan warna visual yang beraneka ragam. Berdasarkan basil uji coba 100 buah manggis diperoleh perbedaan perkiraan kematangan antara ultrasonik dan warna kulit. Perbedaan tersebut mencapai 21%, hal ini menunjukkan bahwa warna kulit belum tentu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah.

Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman Obat

Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).

Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan Karanganyar. Pendekatan terbaik untuk kalibrasi yang diperoleh pada tahun pertama digunakan untuk penyusunan model kalibrasi data persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin tanaman hasil percobaan pada tahun kedua. Model kalibrasi yang diperoleh pada tahun kedua merupakan model terbaik berdasarkan data simulasi, data hasil pengamatan (Karanganyar dan Kulonprogo) serta data hasil percobaan. Pada tahun ketiga dilakukan validasi model kalibrasi yang diperoleh apda tahun sebelumnya dengan cara menerapkannya pada data konsentrasi dan persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan jahe dan temulawak yang diambil dari contoh Bogor, Cianjur, Kuningan, Majalengka dan Sukabumi.